气相色谱法 分析检测小虾中的吲哚

气相色谱法
    
A 试剂
    
A.a 纯化的水
    用Milli-Q水净化系统处理的蒸馏水，或等效的。
A.b 溶剂
    无水乙醚〔含0.05%乙醇〕、乙酸乙酯、正已烷，用玻璃蒸馏器蒸馏。
A.c 碳酸盐缓冲液
    约pH9.6，0.2M Na2CO3和0.2M NaHCO3。21.2g Na2CO3和16.8g NaHCO3溶于水并稀释到1L。
A.d 硅胶
    干的70－230目硅胶60在125℃于敞开的容器中，层厚小于等于2cm，2h。每25g干燥过的硅胶加3g水，在旋转振摇器上大于等于4h，于气密性容器中保存。
A.e 吲哚标准溶液
    
A.e.1 贮备液Ⅰ
    1.00mg/ml。100mg吲哚溶解在100ml容量瓶中的乙醇中，用乙醇稀释至刻度。
A.e.2 吲哚标准溶液Ⅱ
    20μg/ml，吸取2ml贮备液于100ml容量瓶内，用乙酸乙酯稀释至刻度。
A.e.3 吲哚标准溶液Ⅲ
    5μg/ml。吸取25ml标准溶液Ⅱ于100ml容量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度。
A.e.4 吲哚标准溶液Ⅳ
    2μg/ml，吸取10ml标准溶液Ⅱ于100ml容量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度。
A.e.5 吲哚标准溶液Ⅴ
    1μg/ml，吸取5ml标准溶液Ⅱ于100ml容量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度。
A.f 2-甲基吲哚溶液
    
A.f.1 贮备液Ⅰ
    1mg/ml。溶解100mg 2-甲基吲哚于100ml容量瓶中的乙醇内，用乙醇稀释至刻度。
A.f.2 稀贮备液Ⅱ
    50μg/ml，吸取5ml贮备液于100ml容量瓶内，用乙醇稀释至刻度。
A.f.3 工作标准溶液Ⅲ
    10μg/ml，吸取20ml贮备液Ⅱ于100ml容量瓶内，用乙醇稀释至刻度。
B 仪器
    
B.a 气相色谱仪
    带有N-专用检测器。6ft×2mm〔内径〕玻璃柱，填装已二酸新戊烷基乙二醇酯〔NPGA〕或等效的。调节基线电流、空气流速和氢气流速，使5μg吲哚的响应值大于记录仪50%满刻度的读数值〔3μl校准溶液4，表17-1〕，调整色谱条件，使吲哚和2-甲基吲哚的保留时间分别为6.8和9.4min左右。基线变化可得到3-正丁基磷酸酯〔约5min〕、吲哚、3-甲基吲哚〔约8min〕和2-甲基吲哚的色谱峰。
B.b 色谱柱
    下面〔1〕或〔2〕。
B.b.1 NPGA
    在400ml烧杯里，用100ml氯仿溶解1.2g NPGA，搅动溶液加入10.8g、80－100目酸洗过的担体，置于汽浴上，搅动，以蒸发溶剂。转移担体到旋转蒸发器中，以40－50℃、真空去除最后的溶剂。用5%的二甲基二氯硅烷的甲苯溶液充满清洁的干玻璃柱，(a)，静置5min〔注意：二甲基二氯硅烷有毒，避免接触皮肤或眼睛，开启有效的排风装置〕。用约50ml甲醇洗柱，氮气下干燥。用涂渍好的载体装柱，并于室温下，N2气流吹洗大于等于2h，以10ml/min、N2 220℃，老化24h。$$典型条件是：温度〔℃〕－柱，195；汽化室，220；鉴定器，250；载气流速约30ml N2/min。
B.b.2 SuperPak20M
    用5%二甲基二氯硅烷的甲苯溶液，装入清洁的干燥玻璃柱中，静置5min，用约50ml甲醇冲洗，并于N2下干燥。用Super Pak 20M填装柱子，于室温下，用He气流吹洗大于等于3h。以He20ml/min、220℃老化24h。$$典型气相操作条件是：温度〔℃〕－柱，160；进样口，220；检测器，250；载气流速30ml He/min。
B.c WhatmanIPS相分离滤纸。
    
C 校准
    制备校准溶液的体积数如表17-1所示：$$ $T 表17-1 气相色谱测定小虾中吲哚的校准溶液$$校准溶液@吲哚标准溶液@吲哚浓度μg/ml@ml@μg@2-甲基吲哚^a^ml@乙醇ml@总量ml$$1@Ⅴ@1@1@1@1@1@3$$2@Ⅴ@1@2@2@1@0@3$$3@Ⅳ@2@2@4@1@0@3$$4@Ⅲ@5@1@5@1@1@3$$5@Ⅲ@5@2@10@1@0@3$$6@Ⅱ@20@1@20@ 1@1@3$$a.2-甲基吲哚工作标准溶液，10μg/ml。$T吸取规定的体积，分别于带有聚四氟乙烯衬里螺旋盖的小瓶并混匀，冰箱内贮存。$$每种溶液平行进样〔约3μl〕，测量峰高并计算峰高比，R＝吲哚峰高/内标峰高，以R对标准溶液中的吲哚微克数作图，制备标准曲线。
D 测定
    称取25.0g混匀的样品于捣碎机钵内，加100ml碳酸盐缓冲液，高速捣碎2min，定量转移糊状物于500ml分液漏斗中。用洗瓶中25ml水冲洗捣碎器钵，洗液加入分液漏斗内。加200.00ml乙酸乙酯于分液漏斗并剧烈振摇2min。$$使之分层，排下层入烧杯，如乙酸乙酯〔上层〕<150ml，离心下层，分离，合并所得的有机层。使有机层通过Whatman相分离纸，准确量取150ml滤液于玻塞烧瓶中，加1.00ml 2-甲基吲哚工作溶液和10g无水硫酸钠，振摇1min。$$倾出萃取液，在约35－40℃水浴上，用旋转蒸发器浓缩至5－10ml，不要蒸干〔另外，也可在50℃水浴上，氮气流下浓缩〕。转移萃取液到小玻璃瓶中，在氮气流下浓缩至约1－1.5ml，加2ml正已烷并混合，加1.5g无水Na2SO4，剧烈振摇2min。$$制备净化的柱，将玻璃棉紧塞10cm×15mm或10.5mm内径的玻璃色谱柱底部，加6g硅胶并轻轻敲击管以填实，在硅胶层顶部加约0.5cm厚的无水Na2SO4，吸取约2ml正已烷加在柱顶。正已烷被吸收后，立即转移浓缩的萃取物〔含添加的正已烷〕入柱内，使柱层被冲击的可能减至最小。当液体水平面到达Na2SO4顶部时，加10ml正已烷。同样地，加10ml乙醚-正已烷(15+85)和40ml乙醚-正已烷(15+85)。收集全部柱洗脱液，50℃，N2下浓缩至约1.5ml，不要蒸干。$$做平行进样，测量峰高并计算R值，从校准图形上测定样品I〔μg吲哚〕，计算每个样品中的吲哚量。$$ μg吲哚/100g样品＝I×100/[g样品×(150/200)]$$从平行进样的值，计算吲哚的平均量。