芹菜素诱导人卵巢癌细胞凋亡作用及机制研究

     卵巢癌目前仍是妇科肿瘤中病死率最高的疾病。尽管采用了肿瘤细胞减灭术与多种化疗方案，但是其5 a存活率依然无明显改善。因此，探讨新的治疗卵巢癌的药物是目前的研究课题。芹菜素(Api)是一种分布广泛的黄酮类化合物，大量存在于水果、蔬菜、豆类及茶叶中，在芹菜中含量最高。

研究表明芹菜素在体外能够显著抑制多种肿瘤细胞的增殖，其作用机制主要包括以下几个方面：① 诱导细胞凋亡。芹菜素通过提高细胞内活性氧水平，降低线粒体跨膜电位促使细胞色素c(Cyt c)释放并激活capase一9的作用，进而导致细胞内caspase一3蛋白酶活化，引起细胞凋亡 。② 细胞周期阻滞。 芹菜素通过下凋细胞周期蛋白Bl(cyclin B1)的表达及降低cyclin B1结合的周期蛋白依赖激酶CDK1活性将结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤细胞阻滞在G，/M 期 。③ 促进癌细胞分化。

芹菜素可促进HL260细胞向单核细胞分化。细胞凋亡的调控根据其起始信号的细胞部位不同，主要有2条诱导途径：死亡受体途径和线粒体途径，不同的死亡信号通过不同的途径诱导细胞凋亡。最近的研究表明线粒体是细胞内死亡信号的重要感受器与放大器，在细胞凋亡早期，核染色体DNA还未改变之前，已出现结构和功能的变化，说明线粒体在细胞凋亡调控过程中起重要作用 。有研究表明芹菜素经线粒体途径诱导人胃癌细胞BGC823细胞凋亡 。本研究旨在验证芹菜素是否通过活化线粒体信号转导通路诱导人卵巢癌细胞SKOV3凋亡，以期为卵巢癌的治疗寻找新的药物提供理论基础。

1 实验资料

1.1 主要试剂芹菜素genin购自Sigma公司，RPMI一1640培养液购自Gibco公司，新生牛血清购自杭州四季青生物工程公司，罗丹明123，caspase一9分光光度法检测试剂盒购自南京凯基生物公司，caspase一9抑制剂(Ac—LEHD—CHO)购自 Alexis公司，bcl一2、bax、Cyt c、caspase一9，caspase一3和B— actin抗体购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗均购自武汉博士德公司。

1.2 细胞培养 人卵巢癌细胞株SKOV3由河北医科大学第四医院科研中心惠赠。用含有10%小牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI一1640培养液，在37℃ ，5%CO 的饱和湿度的培养箱内培养传代。

1.3 PI染色流式细胞术测定细胞凋亡率 收集PBS、芹菜素 (20，40，80 o.mol/L)作用48 h后的细胞2.0×10 个，用4℃ 预冷体积分数为0.75的乙醇固定细胞，加入碘化丙啶(PI)均匀染色，30 min后用流式细胞仪检测凋亡率。

1.4 细胞线粒体跨膜电位(△II，m)检测 收集PBS、芹菜素(2O，40，80 i~mol/L)和芹菜素 40 I.Lmol/L加Ac—LEHD—CHO作用 48 h后细胞2.0×1O 个，用PBS洗涤细胞2次，重悬于罗丹明123染色液(终浓度5 p,mol/L)中，于37℃ 避光孵育30 min，再用PBS洗涤细胞2次，利用流式细胞仪以罗丹明123 为荧光指示剂检测细胞线粒体A+m 的改变。罗丹明123的激发波长为475 nm，发射波长为525 nnl。

1.5 caspase一9活性测定取未处理和经药物处理48 h的细胞3×10 ～5×10。个，按caspase一9分光光度法检测试剂盒说明书进行操作，即用50 L冰冷Lysis Buffer悬浮细胞，置冰上2O min；4℃ 离心(10 000 r/min)3 min，把离心上清转移至新的管中，置冰上；用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；吸取50 L含5O一200 g蛋白的细胞裂解上清；如体积不足 5O L用Lysis Buffer补足至总体积5O L；加入50 L的2× Reaction Buffer(使用前每5O L 2×Reaction Buffer加入0.5 p,L DTT)；加入5 L caspase一9底物并于37 oC避光孵育4 h；用酶标仪在 ：405 nm测定其吸光值。通过计算OD诱导剂/OD阴性对照的倍数来确定凋亡诱导剂组caspase一9的活化程度。以Lysis Buffer和Reaction Buffer混合物作为参比。

1.6 Western印迹分析收集1×10 个以上细胞，2 500 r/ min离心10 min，冰PBS洗2次，加入100 L细胞裂解液(10 mmol/L Tris—C1，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，20%SDS，5 retool/ L DTT和10 mmol/L PMSF)于冰上裂解1 h，12 000 r/min离心 5 min，收集上清。Lowry法测定蛋白含量。加入20 L的5×上样缓冲液(250 mmol/L Tris～HC1 pH 6.8，10%SDS，50%甘油， 0.5%溴酚蓝，5%二巯基乙醇)，加热变性。用10%SDS一聚丙烯酰胺凝胶(检测Cyt时用15%)电泳分离蛋白质。凝胶上的蛋白带转移到PVDF膜上，封闭液封闭膜上的蛋白结合位点2 h。加入一抗(bcl一2、bax、caspase一9、caspase一3、Cyt C， 1：200；B—actin，1：400)，4℃孵育过夜；加相应辣根过氧化物酶标记的二抗(1：2 000)，37℃孵育1 h。ECL检测，扫描。

收集细胞(1×10“L )，于冰浴预冷的匀浆缓冲液(250 mmol/L Sucrose，20 mmol/L Hepes KOH ，pH 7.5，10 mmol/L KC1，1.5 mmol/L MgC1，，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L PMSF)400 L重悬，移人玻璃匀浆器内于冰浴中匀浆 5 min，匀浆液于4℃ ，3 O00r/min离心10 min，共2次，取上清于4 oC，12 000 r/min离心15 min，收集的上清即为不含细胞核和线粒体的胞浆成分。测定蛋白含量后进行Wester印迹分析。

1.7 统计学处理 实验均重复3次。所有数据用i±s表示，采用SPSS 10.0统计软件对数据进行单因素方差分析 (one—way ANOVA)，P<0.05为有显著性差异。

2 结 果

2.1 芹菜素对SKOV3细胞凋亡的影响PI染色FCM分析结果显示，芹菜素(20，4O，80 p,mol/L)处理SKOV3细胞48 h后的凋亡率分别为13.1%，20.6%和34.O%，较对照组2.9%高。说明芹菜素具有促进SKOV3细胞凋亡作用，呈浓度依赖性。不同浓度的芹菜素处理SKOV3细胞48 h，PI染色FCM 检测细胞凋亡。见图1。

2.2 芹菜素对SKOV3细胞线粒体跨膜电位的影响 用罗丹明 123作为荧光探针测定线粒体跨膜电位，其被线粒体摄取的量与A,m成正比。芹菜素(20，4O，8O~mol/L)处理后，SKOV3 细胞的罗丹明123的荧光强度分别为105.0±3.3，98.4±3.3和65.7±5.0，较对照组138.0±3.5明显降低。不同浓度的 芹菜素处理SKOV3细胞48 h，用罗丹明123不荧光探针测定线粒体跨膜电位，见图2。且随着芹菜素浓度增加荧光强度降低。表明芹菜素降低SKOV3细胞线粒体跨膜电位与剂量呈正相关。

2.3 芹菜素对SKOV3细胞caspase一9活性的影响oaspase一9 是线粒体诱导凋亡途径中的关键caspase，芹菜素(20，40，80 txmol/ L)作用于SKOV3细胞48 h后，分光光度法检测caspase一9活性，结果发现caspase一9活性分别为对照组的5.0，7.0和8.5 倍，而芹菜素 40 ixmoL/L合用caspase一9抑制剂组的caspase一9 活性仅比对照组增加1.4倍，不同浓度的芹菜素处理SKOV3细胞48 h后检测caspase一9活性(i± ，n=3)，见图3。可见 AP1以剂量依赖方式增加easpase一9活性，caspase一9抑制剂能显著抑制芹菜素增强caspase一9活性作用。说明芹菜素诱导 SKOV3细胞凋亡与活化线粒体途径相关。

2.4 芹菜素对凋亡线粒体途径相关蛋白表达的影响 为进一步证实芹菜素通过活化线粒体途径诱导SKOV3凋亡，本研究进一步检测凋亡线粒体途径相关蛋白的表达。随着芹菜素浓度增大，bax蛋白表达增加，bcl一2蛋白表达降低，bax/bcl一2比值逐渐增大，Cyt C释放随芹菜素浓度升高而增加，easpase一9和 easpase一3蛋白表达也随芹菜素浓度升高而增加。easpase一9 抑制剂Ac—LEHD—CHO能阻断芹菜素的上述作用。不同浓度 芹菜素处理SKOV3细胞48 h，Western印迹分别检测，见图4。

3 讨 论

芹菜素可以使人前列腺癌细胞及人白血病细胞HL一60发生选择性周期阻滞，并诱导细胞凋亡。其诱导凋亡的机制可能是通过细胞色素c的释放及半胱氨酸酶(casepase一9，casepase一3)的激活而实现 。此外，芹菜素也可以通过激活 p53/waft途径发挥抗肿瘤作用。芹菜素能使肿瘤细胞内p53蛋白、p21/WAFI蛋白水平升高，二者可以使细胞周期发生阻滞，并通过p53途径诱导肿瘤细胞凋亡。核因子一KB(NF— KB)、B细胞淋巴瘤/白血病2(bcl一2)，bax(bcl一2的家族成员)也参与了芹菜素的诱导肿瘤细胞凋亡作用 。NF—KB 的活化能阻止处于半胱氨酸酶联反应上游的casepase一8活化，并引起凋亡抑制剂蛋白的表达。芹菜素能够抑制NF～nB 蛋白的表达，使bax和bcl一2的比值发生转变，最终诱导细胞凋亡的发生。笔者采用PI染色FCM分析发现：随着芹菜素浓度升高，SKOV3细胞凋亡率增加。说明芹菜素具有促进SK— OV3细胞凋亡作用。

线粒体跨膜电位在维持线粒体膜的完整性和功能方面起着重要作用。本研究用一种能被线粒体选择性吸收的荧光染料罗丹明123作为指示剂，它的吸收率与△ m成正比，FCM 分析测定结果显示，芹菜素能降低SKOV3细胞中罗丹明123的荧光强度，呈剂量依赖性。表明芹菜素能以剂量依赖方式降低 SKOV3细胞中△ m。线粒体依赖性细胞凋亡通路中，线粒体跨膜电位降低导致Cyt C释放增加。笔者用Western印迹检测SKOV3细胞胞浆中细胞色素C蛋白的表达，结果证实随着 芹菜素浓度增大，细胞色素C表达增加。以上结果表明，芹菜素能降低SKOV3细胞线粒体跨膜电位，促进细胞色素C释放。

Cyt C从线粒体释放后与ATP、凋亡蛋白酶激活因子 (Apaf一1)联合作用，依次激活caspase一9，caspase一3和 PARP等，导致细胞凋亡。本实验用caspase一9分光光度法检测试剂盒检测caspase一9的活性，发现芹菜素能增加SKOV3 细胞中easpase一9的活性。用Western印迹检测发现芹菜素能上调caspase一9和caspase一3蛋白的表达。Bcl一2家族成员在细胞凋亡的线粒体途径中起重要调控作用 。在细胞凋亡过程中，bcl一2家族促凋亡成员如bax过表达，形成同源二聚体后被激活，发生构象改变，可引起线粒体大量释放Cyt e；而抗凋亡成员如bcl一2和bcl—XL过表达，与bax形成异源二聚体，可对Apaf一1结构进行调控，抑制Cyt C释放，最终发挥抑制细胞凋亡作用 。笔者用Western印迹检测SKOV3 细胞中bax和bcl一2蛋白的表达情况，发现芹菜素以剂量依赖方式上调bax的表达，下调bcl一2的表达，使bax/bcl一2的比值增大。而caspase一9 抑制剂Ac—LEHD—CHO能阻断芹菜素的上述作用。说明芹菜素 通过调节bax/bcl一2比值激活SKOV3细胞中caspase一9及 caspase一3级联反应。

综上所述，芹菜素能上调bcl一2家族促凋亡成员bax蛋白表达，下凋bel一2蛋白表达，使bax/bcl一2比值升高，降低线粒体跨膜电位，促进Cyt c释放，从而激活caspase～9及 caspase一3级联反应，通过调控线粒体凋亡诱导途径诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡。